单细胞文献速递-2018年7月

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seqFISH技术

内含子序贯荧光原位杂交（sequential fluorescence in situ hybridization，seqFISH），一次成像单细胞内10421个基因。这项工作由加州理工学院生物学教授、陈天桥雒芊芊研究院（Tianqiao and Chrissy Chen Institute）神经科学附属学院成员Long Cai主持。2018年6月7日，论文发表于《Cell》杂志。

每个内含子被都标记上唯一的荧光条码以便显微镜观察。当一个基因被开启时，荧光条码可以指示基因表达的强度和位置。 10421个内含子（即10421个基因）可以同时成像。

文章是：Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH

单细胞水平肺癌T细胞免疫图谱

2018年6月25日，北京大学张泽民课题组联合北京大学第三医院闫天生团队在Nature Medicine杂志发表。在该研究中，研究人员对来自14个药物治疗前非小细胞肺癌患者的外周血、癌旁组织和癌组织的12,346个T细胞进行了单细胞转录组测序，全面描绘和解析了肺癌T细胞群体的组成、谱系以及功能状态图谱。基于T细胞的转录组数据及T细胞受体（TCR）序列，通过生物信息学手段分析细胞的亚群分类、组织分布特征、肿瘤内群体异质性及药物靶基因表达情况，该研究鉴定了跨组织分布的T细胞类群、肿瘤浸润T细胞的组成及亚群间潜在的状态转换关系，提出了新的肺腺癌临床标志物，也为免疫治疗特异性地靶向T细胞亚群提供了新的思路。

文章是：Global characterization of T cells in non-small-cell lung cancer by single-cell sequencing

早在2017年6月16日，张泽民、彭吉润、欧阳文军团队在单细胞水平测序揭示肝癌浸润T细胞的免疫图谱，当时是《Cell》发表。

单细胞水平乳腺癌T细胞免疫图谱

同时Nature Medicine杂志在上述文章在线的同时还再现了另一篇题为Single-cell profiling of breast cancer T cells reveals a tissue-resident memory subset associated with improved prognosis的论文，从乳腺癌入手，用单细胞测序技术分离了6311个乳腺癌T细胞，证明了在浸润性T细胞群体（TILs）中存在显着的异质性，为今后更加精准的对肿瘤进行免疫治疗提供了重要的参考信息

肺癌肿瘤微环境基质细胞表型

2018年7月9号的Nature medicine 杂志上又发表了一篇研究肺癌肿瘤微环境基质细胞表型的文章，主题很简单：就是要揭示肺癌微环境的构成，从基质细胞（stromal cell）亚群、信号通路、关键分子以及肺癌患者生存分析四个层面开展研究。在单细胞测序部分包括了两个步骤，首先是5位肺癌患者共19个样本（癌15，正常4）的单细胞测序。然后是对另外3位患者进行单细胞测序验证，这两组测序数据在Arrayexpress上的代码分别为：E-MTAB-6149和E-MTAB-6653。接下来结合单细胞测序的结果：细胞亚群基本情况、亚群在肿瘤、病人分布特异性、通路活化状态、关键转录因子以及Marker基因的情况与TCGA数据进行联合分析。

文章是：Phenotype molding of stromal cells in the lung tumor microenvironment

肺癌是最为常见的、致死的一类癌症，约85%在组织学分型上属于NSCLC，其中主要为肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）和肺鳞癌（lung squamous cell carcinoma, LUSC）。与小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）相比，NSCLC的范围更广，病因也更为复杂，不过诱发肺癌的主要病因还是吸烟。

2017下半年到2018上半年其它文献

*【1】Cell：开发出空间单细胞测序技术，有助揭示早期乳腺癌*产生浸润性之谜

doi：10.1016/j.cell.2017.12.007

在一项新的研究中，来自美国德州大学MD安德森癌症中心的研究人员报道一种新的遗传模型可能解释着一种常见的被称作导管原位癌（ductal carcinoma in situ， DCIS）的早期乳腺癌如何进展到更为浸润性的乳腺癌。相关研究结果于2018年1月4日在线发表在Cell期刊上，论文标题为“Multiclonal Invasion in Breast Tumors Identified by Topographic Single Cell Sequencing”。

这项研究对如何导致DCI进展到浸润性导管癌（invasive ductal carcinoma， IDC）提供新的见解，并且对为何一些这样的癌症未被检测到提供了更清楚的理解。这一发现的取得多亏于这些研究人员开发出一种新的被称作空间单细胞测序（topographic single cell sequencing， TSCS）的分析方法。

论文共同通信作者、德州大学MD安德森癌症中心遗传学副教授Nicholas Navin博士说，“尽管DCIS是早期乳腺癌中最为常见的形式，且经常可通过乳腺X线拍照检测到，但是这种癌症的10％到30％会进展到IDC。鉴于组织分析存在着若干技术挑战，DCIS如何确切地产生浸润性在基因组上仍未得到很好的理解。”

【2】Cell：利用单细胞RNA测序鉴定嗅觉神经元类型

doi：10.1016/j.cell.2017.10.019

人类的神经系统就像是复杂的电路板。当电线发生交叉或者电路发生故障时，精神分裂症或躁郁症等疾病就能够产生。

长期以来，科学家们一直在努力鉴定大脑回路的形成方式，以便他们能够了解让存在问题的神经元重新连接起来。

如今，在一项新的研究中，美国斯坦福大学的生物学教授Liqun Luo、生物工程与应用物理系教授Stephen Quake及其团队通过逐个细胞地构建出果蝇嗅觉神经元的详细基因蓝图，从而在这个方向上迈出了重要的一步。相关研究结果发表在2017年11月16日的Cell期刊上，论文标题为“Classifying Drosophila Olfactory Projection Neuron Subtypes by Single-Cell RNA Sequencing”。

这项研究的基础想法是理解相对简单的果蝇大脑中的神经元类型，和鉴定指导果蝇大脑中不同类型的神经元准确地形成连接的分子。随着时间的推移，人们想要采用类似的方法研究人大脑中复杂得多的细胞组成，甚至可能有朝一日修复大脑疾病中的错误连接。

【3】如何让单细胞测序变得如此简单？

新闻阅读：Single-cell sequencing made simple

单细胞生物学研究一直是当今的热门话题，而且最前沿的领域就是单细胞RNA测序了（scRNA-seq）。常规RNA测序方法一次性能够对成千上万个细胞进行加工测序，并给出平均差异，但并没有两个细胞是完全一样的，而新型的scRNA-seq方法就能够揭示出制造每一种特异性的微小改变，甚至这种技术还能够阐明完整的新的细胞类型。

比如，当来自博德研究所的研究人员Aviv Regev等人利用scRNA-seq对2400个免疫系统细胞进行探查时，他们无意中发现了一些具有潜在T细胞激活活性的树突状细胞，Regev表示，一种刺激这些细胞的疫苗或能够潜在增强机体免疫系统并且保护机体抵御癌症。当然了，这些发现都是来之不易的，相比大量细胞而言，研究人员很难对单个细胞进行操作，因为每一种细胞仅会产生少量的RNA，对于研究者而言没有犯错的余地；另外一个问题就是如何对大量的数据进行分析，最重要的是，研究者使用的工具可能是并不直观的。

【4】Cell Res：中国科学家发表单细胞表观多组学测序技术的最新研究成果

2017年6月16日，北京大学生命科学学院生物动态光学成像中心汤富酬课题组在《Cell Research》杂志在线发表了题为“Single-cell multi-omics sequencing of mouse early embryos and embryonic stem cells”的研究论文。在国际上率先发展了对一个单细胞同时进行染色质状态、DNA甲基化、基因组拷贝数变异、以及染色体倍性的全基因组测序技术（single-cell COOL-seq），并采用这一技术在单细胞分辨率上系统、深入地解析了小鼠着床前胚胎发育过程中表观基因组重编程的关键特征，以及染色质状态与DNA甲基化之间的互动关系。

现有的基于高通量测序来分析全基因组染色质状态的研究方法通常需要大量细胞（例如ATAC-seq、DNase-seq、FAIRE-seq、MNase-seq等）。即使这些方法可以做到单细胞分辨率，也无法在单细胞分辨率上对多种组学之间的互动关系进行研究。而汤富酬课题组将NOMe-seq（全基因组核小体定位及DNA甲基化组测序）技术和PBAT-seq技术（全基因组重亚硫酸盐测序）巧妙地结合起来，并进行了系统的优化和提高，实现了对同一个单细胞进行多达5个层面的基因组和表观基因组特征的分析。

【5】Science：单细胞RNA测序揭秘两种脑癌的组成

doi：10.1126/science.aai8478

关于两种脑癌的仔细分析发现这两种脑癌竟来自同一种神经前体细胞，可以通过基因突变模式和微环境组成进行区分。这项由麻省总医院（MGH）和博德研究所的研究人员完成的最新研究于近日发表在Science上。

“我们的研究重新定义了两种携带IDH基因突变的相近的胶质瘤——星形细胞瘤和少突神经胶质瘤。”研究共同通讯作者、MGH病理学系和癌症研究中心教授Mario Suvà博士说道，“尽管我们知道这两种肿瘤基因存在差别，但是我们并不知道它们是否具有相同的细胞来源或者它们基因表达的不同是由于遗传、细胞来源还是肿瘤微环境？”

几项最近的研究已经发现了促进肿瘤生长的基因突变，并根据包含肿瘤细胞和微环境中正常细胞的组织样品基因表达分析给肿瘤分类。但是由于这些分析都是根据大块肿瘤组织进行的，因此可能掩盖了许多重要的信息。

【6】Science：重大突破！利单细胞测序揭示免疫细胞衰老之谜

doi：10.1126/science.aah4115

在一项新的研究中，来自欧洲生物信息研究所（EMBL-EBI）、英国剑桥大学、韦尔科姆基金会桑格研究所和英国癌症研究所（CRUK-CI）的研究人员针对免疫系统为何随着年龄的增加而减弱存在的长期争论提出新的认识。他们的发现表明相比于年轻组织中的免疫细胞，衰老组织中的免疫细胞缺乏协作，并且表现出更多的基因表达变化。相关研究结果发表在2017年3月31日的Science期刊上，论文标题为“Aging increases cell-to-cell transcriptional variability upon immune stimulation”。

我们所有人经历与衰老相伴随的功能逐渐下降，但是是什么精确地导致这种下降？它为何在体内不同部分以不同的速率发生？为了寻找答案，科学家们需要在分子水平上揭示每个组织中的所有衰老机制。当前的这项研究着重关注免疫组织，特别是CD4+ T细胞。

【7】Cell：将CRISPR和单细胞RNA测序结合在一起分析基因功能

doi：10.1016/j.cell.2016.11.039

哪些突变组合有助癌细胞存活？大脑中哪些细胞参与阿尔茨海默病发生？免疫细胞如何执行它们的复杂决策过程？如今，在一项新的研究中，来自以色列魏兹曼科学研究所等机构的研究人员在一种方法中将两种强大的研究工具--- CRISPR基因编辑和单细胞基因组分析---结合在一起，从而可能最终有助我们解答这些问题和更多的其他问题。相关研究结果发表在2016年12月15日那期Cell期刊上，论文标题为“Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq”。

这种新技术能够让研究人员在单细胞中操纵基因功能，和非常高分辨率地理解每种变化的结果。他们说，利用这种方法开展的单个实验可能相当于利用之前的方法开展的上千次实验，而且它可能加快基因工程领域的发展。

基因编辑技术CRISPR已正在改变着全世界生物学研究，而且它的临床使用马上就要来临了。CRISPR最初是在细胞中作为一种原始的获得性免疫系统而被发现的：它切割病毒DNA，并将它的部分片段粘贴到它们自己的基因组中来抵抗病毒。

【8】Science最新研究：大规模单细胞测序构建首个人脑神经元表达图谱

dol：10.1126/science.aaf1204

在一项新的项研究中，来自美国加州大学圣地亚哥分校（UCSD）的研究人员开发了首个方法用于人类大脑神经性元不同亚型的鉴定，奠定了"绘制"人脑神经元细胞基因活性方法的基础；同时，可以帮助我们更好的理解人脑正常功能及疾病异常，包括阿尔茨海默氏症、帕金森症、精神分裂症和抑郁症等。通过分离和对单个人类大脑神经元细胞核进行单细胞核转录组测序，研究人员在人脑的六个高级功能区确定了16种神经元亚型。

这项新的研究成果反应了一个逐渐被普遍理解的事实，即个体大脑细胞是独一无二的--这些细胞表达不同的基因，承担不同的功能。为了更好地理解这种多样性，研究人员对分布在脑皮质中6个不同的Brodmann区域，并且承担不同功能的3200多个神经元细胞进行了分析。

UCSD生物工程系张鹍教授表示："这项研究构建了一个完整的体系去观察以及比较单个神经元细胞；这可以帮助我们认清究竟有多少类亚型的脑神经元细胞存在。"通过对这些神经元细胞亚型的认知，研究人员可以构建出人脑细胞"参考图谱"；这是我们理解正常健康大脑与异常疾病大脑的基础。"未来，脑部疾病或异常患者可以根据与'参考图谱'比对的差异，而获得更精准的诊断及个体化的治疗。这与人类基因组图谱的确立非常相似。"张鹍教授表示。

【9】Science：利用单细胞RNA测序分析黑色素瘤

doi：10.1126/science.aad0501

单细胞分析是一种开创性方法，如今在整个生物领域中正被用来研究一个共同的问题：如何研究异质细胞群体中的细胞多样性。这种多样性能够对细胞存活和增殖、对药物疗法和干预作出的反应以及很多其他的生物过程产生深刻影响。单细胞技术已被用于众多研究---比如，研究自身免疫疾病中的免疫反应异质性，研究传染病中的宿主-病原体相互作用，研究人转录组。如今，它被用来研究癌症组织---一种多样性的复杂细胞环境，这经常难倒科学家们。

在过去两年来，在美国布罗德研究所骨干成员、麻省理工学院生物学教授和霍华德-休斯医学研究所研究员Aviv Regev的领导下，计算生物学家、细胞回路专家和布罗德研究所成员Levi Garraway的癌症研究团队合作接受这个挑战。

在一项新的研究中，通过与麻省理工学院副教授、单细胞分析先锋Alex Shalek合作，Garraway团队研究黑色素瘤，即最为致命的皮肤癌。他们的研究有助揭示肿瘤的多样性细胞环境，这不仅对肿瘤中的癌细胞异质性，也对可能影响癌症行为和对治疗作出的反应的T细胞和其他细胞，提供深入认识。

【10】Nature：如何利用单细胞mRNA测序发现罕见细胞类型？

doi：10.1038/nature14966

近日，来自荷兰的科学家在著名国际学术期刊nature上发表了一项最新研究进展，他们利用一种新的计算方法结合转录组测序发现了小肠中一些罕见的细胞类型，这对于深入了解器官的细胞组成，探究健康和疾病状态下的组织生物学具有重要意义。

理解一个器官的发育和功能需要对组成该器官的所有细胞类型的特性有一个清晰的认识。传统发现和分离细胞亚群的方法是基于几个已知的标记基因表达出来的信使RNA或蛋白质实现的。但是对于一些罕见的细胞类型来说，鉴定出它们特定的标记基因目前仍存在很大挑战。而发现一些罕见的细胞类型，如干细胞，短暂存在的前体细胞，癌症干细胞或循环肿瘤细胞，对于深入理解正常和疾病状态下的组织生物学具有非常重要的意义。

为解决这一问题，研究人员首先从培养的小肠类器官中随机挑选了几百种不同的细胞类型进行转录组测序，这种培养的小肠类器官包含了哺乳动物小肠所有的细胞谱系。由于目前可用的计算方法只能对一些丰度较高的细胞类型进行确定，因此研究人员开发了一种叫做RaceID的算法，用于在复杂的单细胞群体中发现一些罕见的细胞类型。

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